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結構生物學對于生物技術、藥物發(fā)現(xiàn)等許多領域都大有裨益，是當今生物學界的研究熱點。在結構生物學領域，最富傳統(tǒng)意義的結構解析方式是X射線晶體學（X-ray crystallography），其研究對象是內(nèi)部質點具有規(guī)則排列性質的晶體。但此方法必須以具有高質量的大尺寸晶體作為前提。然而得到質量較好的晶體對于分子量巨大或者結構柔性的對象來說往往較為困難，尤其是針對膜蛋白這一目前科研人員很感興趣的對象，其結晶難度更大。為了解決這一問題，基于冷凍電子顯微鏡的衍生出了兩種重要的結構生物學技術手段——單顆粒分析技術（single particle analysis，SPA）和微晶電子衍射技術(Micro electron diffraction，MicroED)，本文將對這兩種技術的原理和技術特點進行介紹和對比分析。

在過去十幾年間，SPA和MicroED冷凍電鏡技術有了長足的發(fā)展，正在迅速地超越X射線晶體學，成為研究大分子結構的首選方法。2017年，Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson因冷凍電鏡單顆粒法方面的工作而被授予諾貝爾化學獎；

2018年，MicroED被國際權威Science雜志評選為年度全球十大科技進展之一，共同入選的還有應用RNA干擾(RNAi)技術的基因沉默藥物、單細胞測序追蹤單細胞發(fā)育譜系等十項生命科學、物理、化學等領域中的全球頂尖成果。

冷凍電鏡SPA介紹

SPA原理和發(fā)展歷史：

單顆粒分析技術利用的是電子顯微鏡的成像性質。通過將生物大分子的溶液樣品快速投入至冷卻到液氮溫度的液態(tài)乙烷中，得到冰層厚度合適的冷凍樣品，然后對冰層中均勻分布的生物大分子顆粒進行拍照。通過算法對拍到的上千張不同角度的二維照片進行分析，最終得到蛋白結構，此方法稱之為單顆粒分析技術（single particle analysis）。因此單顆粒分析技術是對冰層中的樣品顆粒進行成像，不需要X射線晶體學所需的晶體。其測試過程示意圖如下，正式進行樣品觀察和數(shù)據(jù)收集之前，樣品還需進行負染篩選，從而得到均一性高的樣品，負染篩選過程一般在200KV的透射電鏡上進行，正式的數(shù)據(jù)收集需要在300KV的透射電鏡上進行。得到二維照片之后還需要經(jīng)歷圖像的預處理，目標樣品顆粒的提取和篩選以及蛋白的三維重構，最終得到蛋白的3D模型。

目前，單顆粒分析技術的分辨率已經(jīng)達到了近原子水平（約3Å水平），用該方法解析出的生物大分子三維結構所占的比例越來越大，而且眾多過去無法解析的無對稱重要生物大分子結構也被解析出來。歸納起來，單顆粒法的發(fā)展得益于以下技術的發(fā)展：

快速冷凍固定技術——這種方式的冷卻速度極快，使得水分子還來不及轉向就被固定在原處，得到的冰層不是晶態(tài)，而是無定形態(tài)，在電子相當于透明。
高‍性能透射電鏡的推陳出新——高加速電壓300KV、球差矯正器、能量過濾器、相位板、高穩(wěn)定性樣品臺等等；
直接電子探測相機——傳統(tǒng)的CMOS相機需要經(jīng)歷電-光-電的轉換，能量利用率低，為了保證一定的圖像襯度，入射電子束的劑量就需要很高。然而生物樣品最怕的就是高劑量電子束。直接電子探測器直接跳過了電-光-電轉換過程，只需要很低劑量的電子束流就足以產(chǎn)生高襯度的照片。
漂移矯正技術——在電子束照射下冷凍樣品會有一個明顯的漂移，使用直接電子探測器，可以記錄在非常短的時間內(nèi)拍攝到的信號，然后對每個時間點的照片上樣品的移動進行校正。SPA優(yōu)勢Advantages
相對于X射線衍射，單顆粒法最大的優(yōu)勢是省去耗時費力的蛋白結晶過程，因此越來越受到結構生物學研究者的青睞。
此外，樣品的快速冷凍處理技術可以使得樣品在接近自然生理的環(huán)境下進行測試；
樣品消耗量極少，僅需0.1mg即可，為研究人員節(jié)省寶貴的蛋白樣品；

SPA不足Disadvantages

雖然SPA無需結晶，但最大的問題是分辨率很難達到X射線技術的水平，一般來說只能到3Å水平。因此一些配體，比如小分子藥物跟靶標蛋白相互作用的結構中，不一定能夠在電鏡的密度圖中觀測到；
小分子量的蛋白質顆粒由于襯度不足，無法得到高分辨圖像，因此SPA要求蛋白質樣品的分子量需要大于200KDa，小分子量的樣品需要通過復合其它蛋白做成大分子量的樣品再進行測試；
測試通量低，SPA樣品需要連續(xù)幾天進行數(shù)據(jù)收集，一般來說，每臺設備一周只能測試1-2個樣品；
SPA對硬件的要求極高，設備昂貴且維護成本高，對實驗人員的操作經(jīng)驗也要求很高，不同的實驗者，成功率可能差別很大。因此，SPA的測試費用讓很多研究人員望而卻步。

SPA案例

單顆粒分析技術不需要得到晶體且樣品使用量非常少，這使得針對難以結晶的蛋白或大分子復合物的研究成為可能。如膜蛋白、抗體-抗原表位鑒定、AAV衣殼等等。

2020年3月發(fā)表在Science雜志的研究通過冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術，確定了與胰高血糖素及不同類別的異源三聚體G蛋白（Gs或Gi1）結合的人源胰高血糖素受體（GCGR）3.7 Å和3.9 Å的結構。該研究的多個結構與藥理學數(shù)據(jù)相結合，為II型糖尿病和肥胖癥的治療提供了重要見解1。

抗原表位即抗原決定簇，是由連續(xù)或者不連續(xù)氨基酸組成的蛋白質三維結構，其特殊三維結構所包含的線性表位和構象表位以及化學特性決定了抗原決定簇的抗原特性。Li等人通過冷凍電鏡SPA解析得到了HPeV3 (EMD-0069)病毒表面抗原決定簇和與抗體結合后復合物的三維結構2，結構示意圖如下所示。

MicroED介紹

MicroED原理

根據(jù)衍射的原理，只要具有波的性質，就能對晶體產(chǎn)生衍射。電子波同 X 射線一樣，照射到類似晶體的樣品上時也能夠發(fā)生衍射現(xiàn)象。所以以電子波為光源的電子顯微鏡除了成像模式外，還有衍射模式。當中間鏡的物平面位于物鏡的后焦面時，將在熒光屏上得到經(jīng)中間鏡和投影鏡放大了的電子衍射譜，即為透射電子顯微鏡的衍射模式。通過電子對微小的晶體進行衍射，收集電子衍射數(shù)據(jù)并進行蛋白質結構解析的方法被稱為MicroED。其測試過程示意圖如下：

MicroED特點

1. 分辨率高，由于電子的波長比X射線的波長更短，則受物質散射強（原子對電子的散射能比 X 射線強一萬倍），所以在理論上能夠達到更高的分辨率。

2. 納米晶體、蛋白質晶體培養(yǎng)難度大大降低。電子衍射在許多方面類似于X射線衍射，同樣依賴于有序的晶體，但MicroED所需的晶體樣品只要求百納米3，比傳統(tǒng) X 射線晶體學所需的晶體體積小數(shù)十億倍4。一方面是因為與X射線相比，電子與原子相互作用的散射截面要大得多5，電子與物質的相互作用也強得多（原子對電子的散射比 X 射線強一萬倍），另一方面是因為非彈性散射釋放到樣品上的能量更少5，所以微米尺寸的晶體就可以產(chǎn)生足夠高的信噪比衍射信號。

3. 樣品不能過厚。當晶體大于3 μm時，電子束將無法穿透樣品，不會產(chǎn)生衍射信息�？紤]到電子的平均自由程，晶體的厚度直接決定了衍射數(shù)據(jù)的質量6。對于300 kV加速電壓得到的電子，其冷凍生物樣品的平均自由程約為350 nm，而對于200 kV加速電壓得到的電子，其平均自由程約為 300 nm7。過厚的晶體會更頻繁的吸收電子，產(chǎn)生更多的多次彈性散射。4. 浸泡成功率高。靶標蛋白-小分子藥物配體的共晶結構是藥物設計過程中最關鍵的信息，共晶復合物往往通過浸泡的方法獲得。小分子更容易進入納米級別尺寸的晶體，且更不易產(chǎn)生晶體破裂等情況，大幅提高浸泡成功率。5. MicroED對設備的要求較低，相對低端的透射電鏡也能實現(xiàn)高分辨率的電子衍射數(shù)據(jù)采集，幾分鐘即可完成一套數(shù)據(jù)的收集，即使需要多套數(shù)據(jù)合并，也能在幾個小時內(nèi)完成，實現(xiàn)快速和高通量測試。

MicroED案例分享

在MicroED發(fā)展初期，溶菌酶、catalase和 Ca2+-ATPase等模式樣品就被解析到原子分辨率。隨著MicroED的進一步發(fā)展，這項技術不再局限于解析模式樣品，來自于瑞典的斯德哥爾摩團隊還解析了α-synuclein中心肽段和R2lox酶8等未知蛋白的結構（見下圖），并且分辨率都高達~1 Å。

MicroED解析的R2lox結構圖

2016年后，MicroED發(fā)展迅速，解析的蛋白質結構的數(shù)量也隨之快速增加，prions和 FUS LC（fused in sarcoma low-complexity domain）等樣品的晶體結構都得到了1 Å左右的高分辨率。而后MicroED解析對象的難度逐漸增加，甚至還包括了復合物和離子通道等膜蛋白，下圖便是MicroED技術解析的GPCR蛋白A2AR。