導(dǎo)讀

哮喘是世界上發(fā)病率和死亡率較高的一種常見慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，它的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但已知該病與多種因素有關(guān)。微生物失調(diào)會加劇肺部炎癥和哮喘相關(guān)癥狀。益生菌已顯示出抗炎作用，并可調(diào)節(jié)腸-肺軸。最近的研究表明，共生微生物群的改變或局部失調(diào)不僅會直接影響定植部位，還會影響遠(yuǎn)端器官和系統(tǒng)。動物實(shí)驗(yàn)表明，通過補(bǔ)充益生菌靶向調(diào)控腸道微生物群，對哮喘有預(yù)防和治療作用。但是益生菌在控制哮喘中的應(yīng)用尚未在人體臨床試驗(yàn)中取得一致的結(jié)果。 本試驗(yàn)旨在研究益生菌在控制哮喘方面的輔助功效，采取隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照方法，安慰劑組（N=26），益生菌組（Probio-M8）（N=29），對第1個(gè)月和第3個(gè)月采集兩組糞便樣品進(jìn)行宏基因組組裝，發(fā)現(xiàn)益生菌輔助治療后腸道微生物恢復(fù)力更高，益生菌組患者糞便中Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium longum和Roseburia hominis等豐度顯著增加；而Clostridiales bacterium的豐度顯著降低。持續(xù)治療3個(gè)月后益生菌組哮喘控制評分比安慰劑組顯著提高。與0天相比，益生菌組顯著降低肺泡中一氧化氮濃度（P < 0.05）。益生菌干預(yù)3個(gè)月后血清代謝組學(xué)顯著改變（P< 0.043），血液中十二烷酸、腸二醇、色氨酸和鞘磷脂等代謝物水平與安慰劑組相比均顯著提高。干預(yù)期間受試者腸道二十二碳四烯酸、內(nèi)油酰乙醇酰胺、赤酮酸、鞘磷脂和膽固醇脂等含量顯著高于安慰劑組（P < 0.05）。結(jié)果表明，Probio-M8與常規(guī)療法協(xié)同作用，通過腸-肺軸調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)血液中關(guān)鍵生物活性化合物的合成和分泌，提高宿主免疫進(jìn)而改善哮喘患者的臨床療效。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采取隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照方法，招募了58名年齡在18-75歲的哮喘受試者參與為期6個(gè)月的臨床試驗(yàn)，其中益生菌組29人（11名男性，18名女性），而安慰劑組為26人（12名男性，14名女性）。益生菌組志愿者每日使用信必可和服用乳雙歧桿菌Probio-M8（2 g; 3×1010 CFU/天），安慰劑組每日使用信必可和服用等量的安慰劑。分別在初始點(diǎn)，第1個(gè)月和第3個(gè)月采集兩組志愿者的糞便樣本，共計(jì)93份，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit對93份糞便樣本進(jìn)行DNA提取，用瓊脂糖凝膠電泳和納米分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量，Illumina HiSeq 2500對得到的DNA進(jìn)行宏基因組測序經(jīng)質(zhì)控后生成630.62 Gbp的高質(zhì)量reads。Binning后得到高質(zhì)量基因組2601個(gè)，去冗余后選出代表性種水平基因組（SGBs）389個(gè)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及受試者排除和納入流程

結(jié)果

1益生菌輔助治療可改善哮喘的治療效果試驗(yàn)期間通過調(diào)查臨床指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)期間，與安慰劑相比益生菌組肺泡中一氧化氮濃度（CaNo；P = 0.038）和呼出一氧化氮濃度（FeNO；P = 0.049）顯著降低，哮喘控制（ACT）評分顯著提高（P < 0.006；圖1a），且持續(xù)治療3個(gè)月后改善效果更加顯著（P <0.022）。與0天相比，益生菌組在干預(yù)1個(gè)月后CaNo、FeNo顯著降低，ACT評分顯著提高（P < 0.05）。此外，益生菌組與安慰劑組在肺功能指標(biāo)(PEF、PEV1、PVC)和嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)等指標(biāo)均未觀察到輔助療效，兩組間各時(shí)間點(diǎn)血清IgE水平無顯著差異，但安慰劑組的IgE水平在干預(yù)期間/后顯著升高。表明Probio-M8作為哮喘治療輔助劑可以顯著改善臨床治療效果。

圖1 哮喘患者臨床指標(biāo)及宏基因組分析流程。（a）治療對哮喘控制分?jǐn)?shù)、肺泡一氧化氮濃度、嗜酸性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、總淋巴細(xì)胞數(shù)、部分呼出一氧化氮濃度和免疫球蛋白E數(shù)量的影響。（b）宏基因組組裝、分箱、比對和聚類流程，生成2601個(gè)高質(zhì)量的SGBs。Pro和Pla代表益生菌組和安慰劑組。

2 哮喘患者腸道微生物的基因組特征

宏基因組測序樣本binning后得到了2601、430和508個(gè)高質(zhì)量、中質(zhì)量和低質(zhì)量的MAG（宏基因組組裝基因組），原始序列和樣本間的平均映射比率為77.21% ± 3.73%，表明大部分基因組屬于已知的微生物群落。經(jīng)drep去冗余后得到代表性的種水平基因組（SGBs）389個(gè)（圖1b），其中包括10個(gè)門、19個(gè)綱、24個(gè)目、39個(gè)科、78個(gè)屬和247個(gè)種。為研究未被發(fā)現(xiàn)的SGBs，將389個(gè)SGBs與IGG和MAGs數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)有62個(gè)SGBs未被注釋到種水平，屬于厚壁菌門（90.32%）。將SGBs與IGG和Cell_MAGs數(shù)據(jù)集進(jìn)行交叉比較，發(fā)現(xiàn)27個(gè)SGB與任何當(dāng)前已知的物種均不匹配（平均核苷酸相似性<95%），從而證明了它們的新穎性。

通過將宏基因組的序列映射到Probio-M8參考基因組，發(fā)現(xiàn)益生菌組的Probio-M8菌株的豐度逐漸增加，而在安慰劑組中則沒有，表明攝入的Probio-M8菌株能夠通過受試者消化道。

3 益生菌輔助治療可調(diào)節(jié)腸道微生物組成通過對哮喘患者腸道微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，安慰劑組的alpha多樣性顯著降低（P < 0.05），而益生菌組保持穩(wěn)定（圖2a），表明攝入益生菌可能有助于維持腸道菌群多樣性。此外，在不同時(shí)間點(diǎn)兩組間beta多樣性無顯著差異（圖2b）。 通過比較益生菌組和安慰劑組在試驗(yàn)前后菌群豐度變化，鑒定出4個(gè)SGBs在0天時(shí)無顯著差異，僅在益生菌組發(fā)生顯著變化，例如Bifidobacterium animalis和Roseburia hominis的豐度顯著增加，而 Parabacteroides distasonis 的豐度在服用 Probio-M8 后顯著降低；在安慰劑組中，鑒定出16個(gè)SGBs在0天時(shí)發(fā)生顯著變化，例如梭菌科、厚壁菌門和一些不可培養(yǎng)的SGBs。其中 Blautia 和 Ruminococcus sp. AF37-6AT的豐度顯著降低，Coprococcus eutactus和Eubacterium sp. CAG:274的豐度顯著增加（P< 0.05）。檢測到3個(gè)SGBs在基線時(shí)沒有顯著差異，但在治療結(jié)束時(shí)在益生菌組和安慰劑組間有顯著差異。與安慰劑相比，益生菌組中Bifidobacterium longum和Prevotella sp. CAG的豐度顯著上升，而 Clostridiales bacterium 的豐度顯著降低（P< 0.05）（圖2c）。

圖2 哮喘患者腸道細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)、多樣性和SGBs特征。（a）益生菌組和安慰劑組在不同時(shí)間點(diǎn)的Shannon多樣性指數(shù)。（b）不同時(shí)間點(diǎn)益生菌組和安慰劑組主坐標(biāo)（PCoA）分析。（c）不同時(shí)間點(diǎn)益生菌組和安慰劑組間SGBs的顯著差異。經(jīng)FDR法校正P值，P < 0.05即差異顯著。Pro和Pla分別代表Probio-M8組和安慰劑組。 4益生菌輔助治療可調(diào)節(jié)腸道微生物代謝模塊和生物活性化合物為了觀察389個(gè)SGBs代謝變化的潛在模塊（GMM），基于MetaCyc和KEGG數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了與哮喘相關(guān)的腸道特定代謝模塊，包括短鏈脂肪酸（SCFAs）、組胺、多不飽和脂肪酸、膽汁酸、色氨酸、鞘脂和維生素D等代謝模塊（圖3a）。所鑒定的GMMs屬于10個(gè)不同的門，主要為厚壁菌門（72.75%）、擬桿菌門（13.11%）和放線菌門（4.11%）。益生菌受試者腸道中更高含量的微生物群（SGBs）參與丁酸合成和色氨酸代謝，而安慰劑組更高含量的微生物群（SGBs）參與乙酸降解。

通過MelonnPan進(jìn)一步預(yù)測腸道微生物群代謝圖譜，共鑒定出80個(gè)代謝產(chǎn)物。Procrustes分析表明在治療過程中，微生物和預(yù)測代謝產(chǎn)物間具有正相關(guān)（R=0.351；P = 0.001）（圖3b）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，益生菌干預(yù)期間受試者腸道二十二碳四烯酸、內(nèi)油酰乙醇酰胺、赤酮酸、鞘磷脂和膽固醇脂等含量顯著高于安慰劑組（P < 0.05）（圖3c）。這些活性代謝物均與調(diào)節(jié)炎癥、免疫功能有關(guān)。提示Probio-M8在調(diào)節(jié)特定生物活性代謝產(chǎn)物和相關(guān)通路方面具有輔助效果。

圖3 益生菌和安慰劑組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道代謝模塊和預(yù)測代謝產(chǎn)物的差異。（a）腸道代謝模塊（GMMs）由益生菌組和安慰劑組之間的特定顯著差異SGBs編碼。圓圈代表SGBs編碼的相應(yīng)代謝模塊。柱狀圖表示益生菌和安慰劑組不同時(shí)間編碼模塊中SGBs的含量。（b）對兩組患者在不同時(shí)間點(diǎn)的預(yù)測微生物組和代謝組進(jìn)行Procrustes分析，顯示微生物組和代謝組之間存在正相關(guān)關(guān)系（correlation=0.351; P =0.001）。（c）預(yù)測不同的生物活性代謝產(chǎn)物對益生菌處理的反應(yīng)。采用FDR法對P值進(jìn)行校正，P <0.05為顯著性閾值。Pro和Pla分別代表益生菌組和安慰劑組。

5益生菌輔助治療可調(diào)節(jié)血清代謝產(chǎn)物為進(jìn)一步探究人類腸道微生物組與宿主代謝之間的相互作用，分析了治療過程中血清代謝產(chǎn)物的變化。PCoA分析顯示，在治療1個(gè)月時(shí)，攝入Probio-M8輕微改變了血清代謝組學(xué)（P < 0.06），在治療3個(gè)月時(shí)顯著改變了血清代謝組學(xué)（P < 0.043），而安慰劑組在治療期間沒有發(fā)生顯著改變（圖4a）。 為進(jìn)一步篩選差異豐富代謝產(chǎn)物，通過PLA-DA模型分析發(fā)現(xiàn)0天時(shí)在益生菌和安慰劑組差異不顯著，而試驗(yàn)期間差異顯著的代謝物有30種（圖4b）。采用血液數(shù)據(jù)庫對其注釋后，發(fā)現(xiàn)有16種代謝物可注釋到對應(yīng)化合物。在益生菌干預(yù)后，血液中十二烷酸、腸二醇、色氨酸和鞘磷脂等代謝物水平與安慰劑組相比均顯著增強(qiáng)（圖4c）。這些代謝物能夠抑制信號通路發(fā)揮抗炎作用并參與免疫反應(yīng)。以上結(jié)果表明，益生菌作為宿主和腸道微生物的調(diào)節(jié)因子，在聯(lián)合信必可治療哮喘的過程中能特異性調(diào)節(jié)部分血清代謝物從而提高臨床療效。

圖4 LC-MS評價(jià)哮喘患者血清代謝產(chǎn)物特征。（a）益生菌組和安慰劑組中的 主坐標(biāo)（PCoA） 分析。安慰劑和益生菌組在不同時(shí)間點(diǎn)的樣本符號用不同顏色顯示。（b）檢測到的代謝產(chǎn)物在基線時(shí)沒有顯著性差異，但在第1個(gè)月和第3個(gè)月時(shí)兩組之間有顯著性差異。（c）益生菌治療后血清代謝產(chǎn)物的變化。采用FDR法對P值進(jìn)行校正，P < 0.05為顯著性閾值。Pro和Pla分別代表益生菌組和安慰劑組。

6 益生菌輔助治療可調(diào)節(jié)腸道噬菌體為研究腸道噬菌體是否發(fā)生變化，使用VIBRANT和DeepVirFinder等預(yù)測工具識別噬菌體序列。預(yù)測到13078個(gè)非冗余病毒OTUs (vOTU)，這些vOTUs的平均基因組大小為28.50 ± 56.17 Kbp，大部分為片段化基因組。其中12.73%的噬菌體可以歸為特定的家族，突出了當(dāng)前噬菌體的新穎性（圖5a）。安慰劑組腸道噬菌體組多樣性顯著降低(P < 0.05)，而益生菌組在治療過程中沒有顯著變化（圖5b），表明益生菌與信比可聯(lián)合用藥有助于維持腸道噬菌體的多樣性。PCoA分析發(fā)現(xiàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)，安慰劑組和益生菌組的整體腸道噬菌體分布沒有顯著差異。(P > 0.05, ANOSIM)（圖5c）。 在受試者腸道菌群中鑒定到10個(gè)噬菌體科，其中最占優(yōu)勢的病毒科是Iridoviridae和Podoviridae。與基線相比，益生菌組Myoviridae的平均豐度在第1個(gè)月時(shí)顯著降低，而Herelleviridae的平均豐度在第3個(gè)月時(shí)顯著升高（圖5d）。當(dāng)噬菌體與細(xì)菌組的多樣性相關(guān)時(shí)（R=0.895; P < 0.001，圖5e），在益生菌組（R=0.916; P < 0.001）和安慰劑組（R=0.873; P < 0.001）也有顯著的相關(guān)性。此外，研究發(fā)現(xiàn)在受試者中，細(xì)菌組與噬菌體組之間存在較強(qiáng)的協(xié)同關(guān)系（correlation = 0.782; P = 0.001）（圖5f），強(qiáng)調(diào)腸道病毒組感染細(xì)菌的專一性。

圖5 哮喘患者腸道噬菌體群落結(jié)構(gòu)，多樣性及噬菌體特征。（a）31441個(gè)DNA病毒操作分類單元（OTU）的質(zhì)量分類和科水平注釋信息。（b）益生菌組和安慰劑組在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的shannon指數(shù)多樣性。（c）益生菌組和安慰劑組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的主坐標(biāo)（PCoA）分析。（d）益生菌組和安慰劑組在科水平上注釋的噬菌體的相對豐度。（e）時(shí)間相關(guān)分析顯示哮喘患者腸道菌群與噬菌體Shannon多樣性指數(shù)之間均存在較強(qiáng)的正相關(guān)（R=0.895; P < 0.001）。（f）對兩組患者不同時(shí)間點(diǎn)的腸道細(xì)菌和噬菌體進(jìn)行Procrustes分析，顯示細(xì)菌組與病毒組呈正相關(guān)（correlation=0.782; P = 0.001）。Pro和Pla分別代表益生菌組和安慰劑組。

7 糞便中的細(xì)菌組和病毒組與血清代謝組、腸道微生物代謝潛能和表型有關(guān)基于Permanova評估細(xì)菌組與生物活性化合物、臨床指標(biāo)、血清代謝物和噬菌體之間的總體影響程度，272個(gè)SGBs（P < 0.05）解釋了這些指標(biāo)的顯著差異。其他組學(xué)的大部分差異來自細(xì)菌（平均值：55.34%，范圍：28.8% - 78.31%）。與安慰劑組相比，菌群在益生菌組解釋的生物活性化合物、臨床指標(biāo)和血清代謝產(chǎn)物的方差分別為9.80%、3.60%和1.30%（圖6a）。此外，在益生菌組和安慰劑組中，影響多組數(shù)據(jù)集排名前20的細(xì)菌包含Bifidobacterium longum、Firmicutes bacterium AM10-47、Ruminococcu ssp. AF37-6AT和Firmicutes bacterium CAG:83等益生菌富集的SGBs。綜上所述，與傳統(tǒng)治療相比，益生菌聯(lián)合信比可治療對腸道病毒群的影響較小，而對臨床指標(biāo)、血清代謝組和腸道微生物代謝潛力的影響較大。

圖6 益生菌驅(qū)動途徑調(diào)節(jié)腸-肺-軸。（a）益生菌組和安慰劑組腸道菌群對腸道微生物活性化合物、血清代謝產(chǎn)物、臨床指標(biāo)和噬菌體組成的影響大小。（b）腸-肺-軸和宿主反應(yīng)的關(guān)鍵益生菌驅(qū)動通路示意圖。Pro和Pla代表益生菌組和安慰劑組。

討論

本研究探討了一種新型益生菌Probio-M8對哮喘癥狀的輔助治療。結(jié)果顯示，相比于安慰劑組，益生菌干預(yù)1個(gè)月后ACT評分明顯改善，且持續(xù)治療3個(gè)月后改善效果更加顯著（P < 0.01）。此外，1個(gè)月時(shí)，益生菌組和安慰劑組呼出一氧化氮濃度均顯著降低（P < 0.05）。與基線期相比，益生菌組在治療期間顯著降低了肺泡一氧化氮濃度（P < 0.05）。在試驗(yàn)期間，安慰劑組血清IgE水平持續(xù)顯著升高，益生菌組無顯著升高，而IgE水平的升高可能會加劇支氣管哮喘患者的癥狀。表明與常規(guī)治療相比，益生菌輔助治療提高了哮喘的臨床療效，減輕了小氣道炎癥。

研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)治療顯著降低了安慰劑組患者腸道細(xì)菌和病毒的alpha多樣性（P < 0.05），但在益生菌組未發(fā)生改變。Dickson等人發(fā)現(xiàn)，藥物治療導(dǎo)致的細(xì)菌多樣性減少通常與哮喘癥狀相關(guān)。兒童過敏性哮喘的發(fā)展與先前較低的腸道微生物多樣性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物的吸入可能會降低腸道菌群的多樣性，而聯(lián)合使用Probio-M8可以增加腸道菌群的順應(yīng)性，保持患者的腸道微生物多樣性。此外，PCoA的結(jié)果表明，緩解癥狀的作用并非由于腸道細(xì)菌和噬菌體群落結(jié)構(gòu)的劇烈變化。益生菌干預(yù)后某些SGBs顯著增加（如B. animalis，B. longum，Prevotella sp. CAG，R. hominis，Ruminococcus callidus），而其他一些SGBs顯著下降（如Clostridiales bacterium，Parabacteroides distasonis）。其他研究也發(fā)現(xiàn)特定的腸道細(xì)菌與哮喘密切相關(guān)，哮喘患者的腸道中Clostridium和Eggerthellalenta的含量高于健康人。一項(xiàng)關(guān)于兒童哮喘患者的研究發(fā)現(xiàn)患者糞便中Streptococcus和Bacteroides的相對豐度增加，而Bifidobacterium和Ruminococcus的相對豐度降低。以上結(jié)果表明，維持健康不僅依賴于腸道的多樣性，也依賴于特定的腸道功能菌株。

有趣的是，Probio-M8治療后，改善了抗炎微生物的生物活性、代謝途徑和血清代謝組。結(jié)果表明，益生菌組患者血液代謝物中的色氨酸含量明顯高于安慰劑組，其顯著增加了具有生物活性潛能的丁酸合成和色氨酸代謝相關(guān)途徑SGBs的多樣性，提高血清色氨酸水平。色氨酸代謝產(chǎn)物與芳香烴受體相互作用，促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)，在體循環(huán)中發(fā)揮抗炎抗氧化作用。先前的報(bào)道稱，妊娠和斷奶期間小鼠口服SCFAs對子代過敏性肺部炎癥有保護(hù)作用，特別是丁酸鹽能有效誘導(dǎo)子代肺部Treg。人類進(jìn)行的多項(xiàng)觀察性研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒期糞便中短鏈脂肪酸的減少與后期的哮喘有關(guān)。綜上所述，SCFAs在哮喘發(fā)生發(fā)展中的十分重要，可能有助于抑制肺部的促炎反應(yīng)。其潛在機(jī)制可能是某些SCFAs為結(jié)腸細(xì)胞提供能量來源，而未代謝的SCFAs進(jìn)入外周循環(huán)和身體遠(yuǎn)端部位（肺部），調(diào)節(jié)Treg淋巴細(xì)胞和各種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活性。此外，研究結(jié)果顯示，益生菌治療后，患者亞油醇乙醇胺、C18:1、膽固醇酯和C18:0鞘磷脂的預(yù)測水平顯著升高，而血液代謝物中鞘磷脂的水平顯著高于安慰劑組。亞油醇乙醇胺是一種生物活性脂肪酸，通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。鞘磷脂存在于動物細(xì)胞膜，先前的研究發(fā)現(xiàn)，早期糞便中鞘脂水平低與食物過敏有關(guān)，因此鞘脂代謝產(chǎn)物可能對哮喘有保護(hù)作用，但是否可能通過其他機(jī)制影響哮喘的病理生理仍需進(jìn)一步研究。

評論

本研究以服用Probio-M8后調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群和相關(guān)代謝為著眼點(diǎn)，對受試者的腸道基因組特征、微生物群組成、腸道噬菌體和相關(guān)血清代謝物等進(jìn)行一系列研究。發(fā)現(xiàn)Probio-M8 通過調(diào)節(jié)腸道菌群和病毒組，提高腸道微生物和血清代謝物的生物活性代謝潛能。同時(shí)，Probio-M8促進(jìn)腸道和血液中一些關(guān)鍵生物活性化合物的分泌和合成，通過體循環(huán)系統(tǒng)直接調(diào)節(jié)腸-肺軸，從而有效緩解小氣道炎癥，改善哮喘患者的臨床癥狀。綜上所述，與常規(guī)方案相比，益生菌聯(lián)合信必可使哮喘患者的臨床療效顯著提高。