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盤點全球主流封閉式細胞治療處理系統細胞與基因治療作為新型生物制藥領域的熱門方向，有許多的企業(yè)投身于研發(fā)、試驗、生產、轉化等等。而在這之中，從最近萬眾矚目的CAR-T療法，到曾獲諾獎的誘導干細胞，再生醫(yī)學領域內的前沿技術都逃不開最基礎的操作：細胞的獲取和培養(yǎng)。然而，要獲得足夠安全且高活性的目標細胞，并不是一件簡單的事。隨著細胞與基因治療領域的飛速發(fā)展，研究者與生產企業(yè)對硬件設施的技術要求也在不斷提高。 近日，ISCT官方期刊Cytotherapy上發(fā)表了一篇題為“Advances in automated cell washing and concentration”的文章，對目前再生醫(yī)學市場中細胞洗滌與濃縮步驟的制備生產過程進行了綜述分析，并對未來的發(fā)展方向做出了推測。
再生醫(yī)學與先進療法的醫(yī)藥產品（ATMPs）包括基因治療、細胞治療和組織工程產品。隨著越來越多的ATMPs準備或者已經進入市場，ATMP的受眾也越來越廣泛，其制造規(guī)模也隨之增加，帶來新的重大挑戰(zhàn)。 為什么選擇自動化封閉式細胞治療處理系統？ 在ATMP的制造過程中，減少液體體積和緩沖液交換都是必不可少的步驟。在該文獻中，自動化的細胞洗滌濃縮過程是指，使用單個設備進行減少液體體積、交換緩沖液和交付最終產品的過程。ATMPs的特殊性在于，其最初的傳統研發(fā)往往在實驗室中小規(guī)模展開，其常規(guī)的制備操作不能滿足市場轉化的需求。對于較大規(guī)模、商業(yè)化的生產而言，自動化的封閉式細胞處理系統是細胞洗滌和濃縮的更優(yōu)選擇。 1）自動化的封閉式細胞處理設備可以在極大程度上降低污染風險 在研究實驗室環(huán)境中，細胞洗滌和濃縮等步驟通常使用臺式離心機完成，然后重復進行手動移液，來獲得最終的細胞懸液。雖然手動過程的部分也可以在符合GMP要求的生物安全柜中進行，但是打開和關閉容器蓋的操作會帶來很高的污染風險，尤其是操作涉及多個培養(yǎng)容器時，污染風險更甚。通過自動化的封閉式細胞處理系統，將分開的多個步驟整合至一個設備中，由此減少了處理的步驟次數與無菌邊界之間相互接觸的數量，以此來降低污染風險。 2）封閉式處理系統或可更有效利用空間 由于將多個設備整合到同一設備中，自動化的封閉式細胞處理系統往往體積不大，可以在保證低污染風險的同時，降低占地空間，這樣能夠更有效地利用潔凈室的面積，也側面可節(jié)省成本。 3）封閉式細胞治療處理系統可以進行模塊化管理，按產品進行定制 這種設備并不是將多個步驟整合為一個步驟，因此可以對不同步驟進行模塊化管理，隨時按照生產需求進行模塊修改，也就可以按照客戶需求定制最適合其產品的工作流程和平臺選擇。目前使用最廣泛的模塊化設備類型之一就是細胞洗滌濃縮處理平臺。 4）對操作員工的要求更低，降低對GMP規(guī)范要求的培訓，減少了人工成本 全自動的封閉式細胞治療處理系統通常會配備有直觀的程序軟件，以便用戶操作、設計和管理。同時，因為無需操作人員直接處理細胞，也就減少了對員工操作的培訓成本，使生產過程更便捷。 選擇自動化封閉式細胞洗滌和濃縮設備時的考慮因素 目前市面上已經有多款自動化封閉式細胞治療處理系統可供選擇，但是各有優(yōu)劣。同時，不同的細胞治療產品也有著不同的需求，想要構建一個最適合產品的自動化流程鏈，需要對產品的技術和設備的技術都有深入的了解。
1）從細胞來源的角度而言： 細胞的來源可分為自體細胞和同種異體細胞產品，這二者對生產加工的核心需求是不同的，如細胞數產量、活性和細胞濃度等，因此對設備的選擇也不同。 洗滌和濃縮的步驟可發(fā)生在細胞富集過程的初始步驟，也可應用于中間過程來改變介質或在制備結束時來濃縮細胞懸液，最后用于產品配方和灌裝。 對自體細胞產品而言，設備的最小處理量和活細胞回收率的能力是重點考慮的因素。較低的活細胞回收比例會導致最終這一細胞治療產品生產失敗。而當制備濃縮的細胞懸浮液時，最小輸出量也是制備能否順利進行的關鍵。 例如，當通過電穿孔法制備CAR-T細胞產品時，細胞濃度需要保持在40-300x10^6個細胞/mL。通常情況下，對于單采來說，一個細胞洗滌裝置需要能夠將收集的產物濃縮至體積小于10mL，才能適用于電穿孔。而目前只有少數封閉性細胞治療處理設備能達到這一要求（如Rotea、Sepax、Ekko等）。 此外，部分產品還需要具有細胞分選功能的自動化設備。例如，來源于血液成分的ATMP還需去除紅細胞或者從中分選所需細胞。Rotea、Lovo、Sepax、Elutra等設備不僅可以交換緩沖液來洗滌細胞，還能同時去除紅細胞，在同一步驟中實現更多處理，從而最大限度降低工藝開發(fā)成本。 對同種異體細胞產品而言，最大處理量才是較重要的因素。主要考慮的是起始材料的輸入體積范圍。對于同種異體產品而言，其起始材料的體積可小到50mL（如臍帶血來源），進行細胞擴大培養(yǎng)后體積可大至1000L。所以對設備的體積處理量要求較高。 影響洗滌和濃縮設備選擇的另一個關鍵因素是處理速度和時間。任何對細胞質量的負面影響（例如剪切應力）都可能會在下游設備處理中被放大。另外，轉染、轉導、酶消化或細胞分選等過程都會給細胞施加壓力，使其對洗滌和濃縮的操作更加敏感，不易控制。 不過，鑒于處理速度可能會因每次制備時培養(yǎng)基的組成和細胞密度的不同而改變，或許只能通過在正式生產制備前先對樣品進行洗滌濃縮，來幫助確定后續(xù)生產的條件設置。在高密度的細胞懸浮液（>5x10^5個細胞/mL）中，細胞可以形成細胞簇并從懸浮液中分離，基于聲學的設備可以更高效地處理這樣的懸浮液。相比之下，以過濾為原理的設備（例如Lovo）則受到最小輸出量的限制。
標黃為可做細胞分選步驟的設備（圖源：文獻） 2）從設備角度而言： 可整合性是自動化封閉式細胞治療處理系統的核心價值。自動洗滌和濃縮設備作為加工鏈的一部分，是以模塊化的方式與其他設備進行物理連接，這其中如何規(guī)劃和評估設備的互相連接方式是十分重要的。 如果試劑是包裝在袋子中，則洗滌和濃縮裝置的設置方式可能很簡單。因為包裝袋可以和幾乎所有設備兼容，在管道尺寸合適的情況下，通過尖刺的端口或者無菌焊接連接即可。但如果是采用了其他形式的包裝，需要增加一個將材料先轉移到袋子中的步驟，再進行無菌連接和洗滌濃縮的。所以，如果這次轉移不能實現無菌連接，則自動化設備消除污染風險的價值將大大降低。理想狀態(tài)下，濃縮后的產品也應該通過封閉設備轉移到下游的流程中（如制劑和分裝）。 此外，設備的占地面積和移動性也是考慮因素之一。潔凈室空間通常是有限的，而可移動的設備增加了便利性，不同房間中移動無需重新校準，降低了制備的復雜程度。 再者，軟件集成也是封閉式細胞處理系統的重要組成。集中的電子記錄使操作可以自動化，能夠取代批次間生產和質控的手動記錄。此外，匹配的控制軟件還可以擴展到應用同一集中式系統的多個設備上，這樣可以控制所有連接的設備并提供實時反饋。目前，軟件輔助控制流程自動化還僅限在同一制造商的設備上應用。若要開發(fā)定制系統，那么從不同設備提取加密數據將成為一個挑戰(zhàn)，并且需要大量投資研發(fā)。 3）從流程設計角度而言： 工藝開發(fā)的目標是開發(fā)一種穩(wěn)健的、可重復的工藝，該工藝可擴展用于臨床生產，同時保持產品質量，并滿足監(jiān)管要求。一種穩(wěn)定、合適的洗滌和濃縮工藝應該做到不隨材料的變化改變其生產的穩(wěn)定性。 要開發(fā)這樣一種工藝，需要大量的努力來確定和控制過程的關鍵工藝參數，重復的多變量分析有時是必不可少的。例如，基于離心的過程的關鍵過程參數可能包括流量速度、離心速度和沉降時間。優(yōu)化這些參數時，應考慮工藝參數與產品質量之間的關系，以確保制造工藝適合規(guī)�；a。 對于細胞內部一致性較低的產品（如自體細胞產品），還可以開發(fā)預測算法來指導制造步驟，以實現所需的產品輪廓。 開發(fā)的過程還應考慮成本問題。除了設備本身的資金投入，應注意的是，選擇不完全合適的設備可能會增加額外的成本。 目前市場上的部分全自動封閉式細胞治療處理系統 封閉式細胞治療處理系統通常包括一個核心儀器、配套的程序軟件和相關套件，可以通過軟件和套件的更換來滿足不同的細胞處理需求。 賽默飛：Gibco CTS Rotea逆流離心細胞處理系統[1] 賽默飛依托其卓越的生命科學試劑和分析儀器平臺底蘊，構建了封閉式、模塊化和自動化的CTS細胞治療端到端生產平臺，Gibco™ CTS™ Rotea™ System是CTS細胞生產平臺中關鍵的工藝設備。該系統由一臺小巧的多功能主機、一次性使用無菌套件，以及直觀、可視化、可定制程序的軟件組成。它們共同構成了一個封閉式細胞處理系統，可以高效、靈活地進行細胞的分離、濃縮、洗滌、緩沖液置換和凍存，旨在幫助細胞治療產品從實驗室研發(fā)環(huán)節(jié)轉化到臨床試驗、乃至商業(yè)化生產中。
Gibco™ CTS™ Rotea™ System不但能夠與賽默飛其他設備像Xenon電轉儀，搖擺式生物反應器Rocker等組合成CTS細胞生產平臺，而且也能與市面上的其他工藝設備比如細胞工廠， G-Rex培養(yǎng)瓶實現工藝銜接。賽默飛也在CTS細胞生產平臺基礎上開發(fā)一種數字化軟件解決方案，以提供與DeltaV平臺（DeltaV是一個在生物生產和制藥行業(yè)廣泛使用的自動化系統）的直接連接，實現全自動過程管理和細胞工藝數據完整性與追溯性。 美天旎：CliniMACS Prodigy平臺[2] CliniMACS® Prodigy是由Miltenyi Biotec公司在美天旎成熟的磁珠分選MACS®技術和CliniMACS® Plus系統基礎上開發(fā)出的一款集合細胞分選、細胞離心、清洗和細胞培養(yǎng)等多種功能于一體的全自動細胞處理系統。新的CliniMACS Prodigy®平臺提供用于精簡的高級集成解決方案細胞處理工作流程：從細胞分離，通過細胞培養(yǎng)，形成最終的產品。其核心離心技術為密度梯度離心，可自動檢測林白細胞分離白膜層，并進行分層，還可以分離血液中的血漿、白細胞、紅細胞等成分。
Cytiva：Sefia和Sepax系統[3][4] Cytiva(前身為GE醫(yī)療集團生命科學部)的Sepax和Sefia系統來自于Biosafe Group SA。Biosafe Group成立于1997年，活躍于自動化細胞處理系統的設計、制造和市場營銷。2016年7月13日，GE 醫(yī)療對外宣布收購了Biosafe Group SA。 Sepax系統的產品包括Sepax2和Sepax C-Pro，后者是在前者基礎上更進一步更新開發(fā)而來的。Sepax系統均是基于Biosafe Group的軸向離心專利技術，Sepax C-Pro細胞處理系統可用于多個細胞處理的步驟，支持安全、可再現、標準化的程序。主要特點有：
Sefia S-2000細胞處理儀是Cytiva推出的大體積連續(xù)流細胞處理系統，Sefia S-2000細胞處理儀結合PremierCell Sefia協議軟件和CT-300.1 Sefia細胞分離套件，可以從多達880ml的單采產品中分離細胞；若配合FlexCell Sefia軟件和CT-800.1 Sefia細胞分離套件，則可以收獲高達10L的擴增細胞。 FloDesign Sonics/MilliporeSiGMa：Ekko系統[5] Ekko是使用低能量超聲技術進行過濾分離的封閉式細胞處理系統，其超聲室設計通過重力、流體阻力和初級和次級聲力的組合，使細胞聚集最大化，從而能夠“捕獲”如淋巴細胞這樣的低密度細胞，因此更適用于處理高聲學對比度(如微載體)和高細胞密度(如單采單元)的原料，可以直接進行灌注。該系統配有觸摸屏的控制頁面和分步說明，便于操作人員的培訓和使用。Ekko系統可對原料進行聚合、擴增等處理，可以在制備擴增后的同種異體CAR-T細胞的過程中去除TCR+細胞，實現細胞分選。 Terumo BCT：Elutra系統[6] 該系統也采用逆流離心技術，是由COBE光譜單采系統和血小板白細胞減少系統工具包改造而成的細胞處理設備。目前Elutra可應用于從單采產物中分離單核細胞、用于樹突狀細胞為基礎的癌癥疫苗以及用于T細胞治療的淋巴細胞富集等。該系統可獲得高純度和回收率的細胞群，無需梯度溶液或價格昂貴的磁珠，從而降低生產成本，同時減少磁珠或梯度溶液在最終產物中的污染。磁珠提取的步驟的去除還可以提高最終細胞數量。 Fresenius Kabi：Lovo系統[7] LOVO是一種通過旋轉膜過濾技術清洗、濃縮和純化白細胞的自動化細胞處理系統。該系統使用的是獨特的泰勒-庫埃特微旋流技術，對細胞損傷低。該系統最大可處理21L的源液體積，通過多重疊加過濾純化技術，其源液去除率最高可達99.9999%。其細胞洗滌采用懸浮法，避免了離心法會導致的細胞堆積問題。該系統的高效換液使其能夠快速去除血小板或其他小分子物質，減少純化步驟。主要特點為：
賽多利斯：Ksep系統[8] Ksep系列的封閉式細胞處理系統包括Ksep400和Ksep6000S。Ksep6000S有6個加工室，每個加工室的體積可達1L，能夠連續(xù)加工高達6000L的體積。最近的一項研究中提到，Ksep400可在2小時內完成50L多能干細胞的洗滌濃縮過程，細胞回收率達到90%以上，且對細胞活力沒有負面影響。 賽多利斯的Ksep®是一項專利技術，該系統可以選擇性地清除細小顆粒雜質，例如產生的塑料、細胞碎片、細胞外病毒等，在生產過程中進行分離。其內置可擴展性（4-6倍），便于利用相同的系統進行開發(fā)和生產，無需稀釋即可從漿液中回收上清液。此外，通過保持細胞完整，還減少了細胞內蛋白質的污染。 博雅/ThermoGenesis：AXP Ⅱ系統/X-LAB/X-WASH/PXP系統[9][10][11] AXP® II系統是一種臍帶血處理系統，旨在與ThermoGenesis提供的特定且兼容的一次性分離套件結合使用，供實驗室使用。AXP II系統允許在封閉和無菌環(huán)境中快速、自動化和可重復地分離臍帶血。系統包括AXP II設備、AXP II擴展塢、AXP加工袋套裝、XpressTRAK軟件和相關配件。 該系統可以收集血沉棕黃層、紅細胞和血漿等組分，活CD34+干細胞回收率大于97%，高于其他可用系統。此外，用AXP處理的臍帶血單位(CBU)比具有相似總有核細胞(TNC)的常規(guī)處理單位含有更多的單核細胞(MNC)，血細胞比容在最終儲存量中始終小于30%。 X-WASH是一種簡單但功能強大的基于沉淀的系統，允許將細胞樣品受控分離、洗滌和減少體積到新鮮培養(yǎng)基中。PXP系統則是一種用于臨床的自動化封閉式骨髓細胞處理系統，可以減少最終骨髓濃縮物中的紅細胞污染，同時保持高濃度的造血干細胞和祖細胞群。除了保持對CD34+干細胞和MNC的高回收率之外，該系統還可以在不到20分鐘的時間內快速濃縮骨髓，紅細胞消耗率超過98%。 2021年2月，該公司向FDA提交了其更新的PXP-LAVARE系統的備案。PXP-LAVARE系統是符合GMP的自動化細胞處理系統，可以快速、自動化和可靠地清洗和重組細胞懸液，設計用于與PXP-1000系統一起使用。PXP-1000系統是用于下游cGMP合規(guī)的細胞療法臨床制造的一種醫(yī)療設備，可用于CAR-T細胞的臨床用生產。 PXP®系統主要優(yōu)點是實現大于98%的紅細胞去除率。但最大缺點是需要依賴離心機才能完成細胞處理，相比其他細胞處理系統的人力操作介入比較多。 Lonza：Cocoon平臺[12] Cocoon系統是一個自動化、封閉式的單一系統，以幫助開發(fā)用于自體細胞治療生產，可通過模塊化設計用于多種不同的自體細胞的活化，增殖和收集等處理，包括CAR-T、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)和間充質干細胞(MSC)等。 2018年Lonza收購Octane80%的股權后，對Cocoon系統進行了重大改進。改進后的Cocoon平臺提高了其系統的穩(wěn)健性，并通過所有的監(jiān)管、安全和質量要求，擴大生產，并獲得了歐盟CE標志以及DMF遞交等，使其能應用于商業(yè)銷售和臨床生產。此外，該系統還基于Lonza Nucleofector系統，添加了整合式磁性細胞分離和整合式細胞電轉。 Cocoon平臺還可對溫度、氣體、pH和DO進行監(jiān)測；通過集成的4°C冷室進行細胞培養(yǎng)；可預加載過程試劑；信息記錄和控制，以實現數據可追溯性。該平臺目前已與部分臨床試驗展開合作。 深研Eureka bio/百泰克：CellSep Pro[13] CellSep Pro是一款用于PBMC外周血單核細胞分離的全封閉自動化細胞處理系統，其分離原理和Sepax相似，均采用軸向離心原理，可通過預設的工藝程序，實現細胞分離、細胞復蘇、細胞濃縮洗滌、細胞分裝等。 PBMC分離程序的起始血量最低可至30mL，最高達150mL，細胞洗滌程序起始細胞液量可達到2000mL。 CellSep Pro軟件操作系統簡單易上手，配置Linux內核，相對較開放，用戶可以根據自己的需求設置用戶權限、工藝參數，且細胞數據完整、可追溯。 小結 只有深入了解制造過程中的關鍵需求以及每種技術的優(yōu)缺點，才能選擇出合適的自動化解決方案。一般來說，新一代的洗滌濃縮設備更受歡迎，因為它們占地更小，易于使用和軟件支持。Sepax和Sefia等系統的處理參數類似于臺式離心系統，因此其開發(fā)過程更加直觀，適用于經驗較少的團隊；Lovo系統可以去除DMSO，并處理低密度的細胞，可能更適合兒科應用；Ekko系統適用于處理高聲學對比度(如微載體)和高細胞密度(如單采單元)的原料；Rotea系統則在自動化編程方面具有很大的靈活性，體積控制比較精確且處理體積范圍寬廣比較適合希望根據自己的需求定制流程的用戶。隨著ATMP的制造過程中的工藝穩(wěn)健性的要求提升，體積控制比較精確的Rotea系統開始被越來越多的用戶引進。 未來在這一領域的發(fā)展可能會發(fā)展更靈活和定制的模塊化設備組件，而不是開發(fā)新的設備。在這一方向下，如何連接不同設備將是一個挑戰(zhàn)。未來的發(fā)展也將鼓勵細胞治療技術的開發(fā)者和設備技術行業(yè)伙伴之間的合作，在細胞制造領域提出創(chuàng)新的解決方案。 |
